检测细胞线粒体膜电位变化

原理步骤

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原理

线粒体跨膜电位Dymt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体Dymt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。

线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine123，3,3-Dihexyloxacarbocyanineiodide，Tetrechloro-tetraethylbenzimidazolcarbocyanmeiodide[JC-1]，Tetramethylrhodaminemethylester(TMRM)(终浓度为Rhodamine123(1mM)，DiOC6(25nM)，JC-1(1mM)，TMRM(100nM),37°C平衡30min)等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。

举例

JC-1是一种阳离子型的亲脂性染料，能够自由穿过细胞膜，随细胞膜电位的变化而在膜两侧保持动态平衡。JC-1很容易进入正常细胞的线粒体中并以多聚体的形式存在，发出明亮的红色荧光；在凋亡细胞中，由于线粒体膜电位的崩溃，进入线粒体的JC-1减少，并以发出绿色荧光的单体形式存在，由于受到胞浆内JC-1单体的影响，一般以细胞内红色荧光的强弱反应膜电位高低；因此可用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。

（JC-1分子量652.23，用DMSO溶解，储存浓度为5mg/ml，终浓度稀释为10ug/ml）

步骤

接种细胞：96孔板（每孔1.5万细胞）或内置盖玻片的24孔板（每孔9万细胞）。6孔板（每孔15万细胞）；

JC-1孵育：对6孔板的一个孔，吸除培养液，可洗涤细胞一次，加入1mlPBS。六孔板加入4ulJC-1，终浓度为10ug/ml，培养箱孵育20min；

检测：用PBS洗1-2遍，96孔板在多功能荧光酶标仪检测荧光值，盖玻片或6孔板可在荧光显微镜下检测荧光变化，检测JC-1单体时激发光设置为488nm，发射光设置为530nm；检测JC-1聚合物时，激发光设置为529nm，发射光设置为590nm。也可将细胞消化下来，加入500ulJC-1染液，避光静置15min，后离心5min，用300-500ulPBS重悬后测流式。

注意：稀释JC-1时要迅速，否则易聚集，不易溶解。

实验专栏主编

小笔，浙江大学药学院一名普通老博，“长期奋斗”在肿瘤药理及神经药理学领域，经常跟老鼠细胞啥么的打交道，虽然毕业滚蛋了，但仍然会活跃在这几个领域继续做实验，聊八卦。其实小笔最初的自我定位是成为一枚文艺女青年，不过每天在实验室泡着久而久之也就只是枚伪文青了。小笔想用一颗文艺加逗比的心，把枯燥的实验操作转化为轻松清新的语言传递给大家，生活还是可以很美好，课题实验也还是可以继续哒!

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